リアルタイムPCRの原理

リアルタイムPCR法とは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニターし解析する方法であり、電気泳動が不要で迅速性と定量性に優れています。この方法にはサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムPCR専用の装置が必要です。
リアルタイムPCRによる定量の原理を下図に示します。段階希釈した既知量のDNAをスタンダードとしてPCRを行います。
これをもとに、増幅が指数関数的に起こる領域で一定の増幅産物量になるサイクル数(threshold cycle;Ct値)を横軸に、初発のDNA量を縦軸にプロットし、検量線を作成します。
未知濃度のサンプルについても、同じ条件下で反応を行い、Ct値を求めます。この値と検量線から、サンプル中の目的のDNA量を測定します。
通常、リアルタイムPCRのモニターは蛍光試薬を用いて行います。蛍光モニター法にはいくつかの方法があります。


1. インターカレータ-法

二本鎖DNAに結合することで蛍光を発する試薬(インターカレーター:TB Greenなど)をPCR反応系に加える方法です。
インターカレーターは、PCR反応によって合成された二本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発します。
この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターできます。
また、増幅DNAの融解温度を測定することもできます。

インターカレータ-法の原理

☆代表的な試薬☆
2ステップ用試薬
【10秒伸長で迅速解析、高感度qPCR試薬】
TB Green Fast qPCR Mix

【幅広いターゲットに対応する定番qPCR試薬】
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)

【究極の特異性、高速反応、コンタミ防止など優れた試薬】
TB Green Premix Ex Taq II FAST qPCR
1ステップ用試薬
【高感度・高特異性のPLUS版1ステップqPCR試薬】
One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

【高感度・簡便な1ステップqPCR試薬】
One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

受託サービス

Perfect Real Timeサポートシステム for インターカレーター

インターカレーター法(TB Green検出)によるリアルタイムRT-PCR用に最適化されたプライマーを検索・オンライン注文するためのシステムです。ヒト、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ニワトリ、イネ、シロイヌナズナのRefSeq登録遺伝子またはEnsembl Plants登録遺伝子に対して網羅的にリアルタイムRT-PCR用のプライマーを設計しています。


2. プローブ法(5'-ヌクレアーゼ法)

5′末端を蛍光物質(FAMなど)で、3′末端をクエンチャー物質(TAMRAなど)で修飾したオリゴヌクレオチド(プローブ)をPCR反応系に加える方法です。 プローブは、アニーリングステップで鋳型DNAに特異的にハイブリダイズしますが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制されます。 伸長反応ステップのときに、Taq DNAポリメラーゼのもつ5′→ 3′エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられます。

プローブ法原理

☆代表的な試薬☆
2ステップ用試薬
高いPCR阻害物質耐性と高速反応性能を両立
Probe qPCR Mix

PCR産物のキャリーオーバーによる偽陽性防止
Probe qPCR Mix, with UNG

マルチプレックスqPCRに最適化、高感度・高定量性を実現
Probe qPCR Mix MultiPlus
1ステップ⽤試薬
高感度検出に威力を発揮
One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

反応阻害物質にも強く、粗抽出RNAでも対応可能
One Step PrimeScript III RT-qPCR Mix

様々な生体試料からRNA精製不要で直接使用可能
PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix

受託サービス

Perfect Real Timeサポートシステム for プローブ

プローブ法によるリアルタイムRT-PCR用に最適化されたプライマー・プローブを検索・オンライン注文するためのシステムです。 ヒト、マウス、ラットのRefSeq登録遺伝子に対して網羅的にリアルタイムRT-PCR用のプライマー・プローブを設計しています。


3. サイクリングプローブ法

サイクリングプローブ法は、RNAとDNAからなるキメラプローブとRNase Hの組み合わせによる高感度な検出方法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の特定配列を効率良く検出することができます。 プローブはRNA部分を挟んで一方が蛍光物質(リポーター)で、もう一方が蛍光を消光する物質(クエンチャー)で標識されています。 このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより蛍光を発することはありませんが、配列が相補的な増幅産物とハイブリッドを形成した後にRNaseHによりRNA部分が切断されると、強い蛍光を発するようになります。 この蛍光強度を測定することで、増幅産物の量をモニターすることができます。 サイクリングプローブのRNA付近にミスマッチが存在すると、RNaseHによる切断は起こりませんので、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出が可能です。

サイクリングプローブ法の原理

☆代表的な試薬☆
サイクリングプローブ法試薬

CycleavePCR Starter Kit

CycleavePCR Reaction Mix



合成サービス

キメラプローブ合成