プライマーの使用法について　－プローブ法によるリアルタイムRT-PCR －

■プライマーの種類と使用用途

Perfect Real Timeサポートシステムでは、下記2種類のプライマーから選択できます。
  • R：逆転写反応にRandom Primerを用いる実験に使用できる。
  • dT：逆転写反応にOligo dT Primerを用いる実験に使用できる。
    遺伝子の3´末端から1,500塩基以内の領域に設計。
R、dTは検索結果のpositionの欄でご確認いただけます。

■逆転写反応用プライマーの選択

逆転写反応には、Random 6 mers、Oligo dT Primer、遺伝子特異的プライマーの3種類が使用できます。
Random 6 mersとOligo dT Primerの両方を用いるとmRNA全長にわたり効率よくcDNAが合成されます。

Random 6 mers

一般的な遺伝子発現解析には、Random 6 mersを使用してください。Random 6 mersを使用すると、PCR用プライマー位置によらず効率の良い逆転写反応を行うことができます。

Oligo dT Primer

polyAからの逆転写を行いたい場合には、Oligo dT Primerを使用します。 その際、PCR用プライマー位置がpolyAから離れすぎていると、効率よく逆転写反応をすることができません。Oligo dT Primerを単独で使用する場合は、できるだけpolyAから1.5 kb以内に設計されたPCR用プライマーと組み合わせて使用してください。

遺伝子特異的プライマー

特定の遺伝子のみを検出する場合には、遺伝子特異的プライマーを逆転写反応に使用できます。この場合、PCR用のReverse Primerを逆転写用プライマーとして使用します。

※ pri-miRNAの様な短鎖RNAの場合には、NucleoSpin miRNA（製品コード 740971.10/50/250）などのsmall RNA精製用試薬 またはRNAiso Plus（製品コード 9108）などのAGPC試薬によりRNA精製を行い、逆転写反応にはRandom 6 mersをお使いください。 total RNAやpolyA＋ RNA精製用のスピンカラムタイプのRNA精製試薬はsmall RNA画分がフロースルーに排出されてしまうため、miRNA精製に使用できません。

※ lincRNAの逆転写反応にはOligo dT Primerが使用できます。 その他polyAを持たないnon-coding RNAの逆転写反応にはRandom 6 mersをご使用ください。


■使用方法

（1）用意するもの（主なもの）

  • PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) （製品コード RR037A）：逆転写反応用
  • Probe qPCR Mix （製品コード RR391S/A/B）：リアルタイムPCR用＊1
  • リアルタイムPCR用プライマー＊2
  • 蛍光標識プローブ
  • 鋳型（total RNA）
  • リアルタイムPCR装置と専用チューブ・プレート
＊1 基本的に、高いPCR阻害物質抵抗性と高速性を両立したプローブ検出専用試薬RR391S/A/Bの使用を推奨します。
＊2 Forward primer, Reverse primer各10 pmol/μlのプライマー溶液を調製して使用します。

（2）プロトコール

逆転写反応
  1. 下記に示す逆転写反応液を氷上で調製する。
    RNAサンプル以外のコンポーネントを必要本数＋α調製し、マイクロチューブに分注後、RNAサンプルを添加する。

    ＜1反応あたり＞　 横にスクロールできます
    試薬 使用量 最終濃度
    （または添加量）
    5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μl 1×
    PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μl
    Oligo dT Primer (50 μM) *1 0.5 μl 25 pmol
    Random 6 mers (100 μM) ＊1 0.5 μl 50 pmol
    total RNA
    RNase Free dH2O
    Total 10 μl＊2

    ＊1 Oligo dT PrimerとRandom 6 mersの両方を用いるとmRNA全長にわたり効率よくcDNAが合成されます。
    なお、各プライマーを単独で用いる場合およびGene Specific Primerの場合の使用量は以下の通りです。


    プライマー 使用量 　添加量
    Oligo dT Primer（50 μM） 0.5 μl 　 25 pmol
    Random 6 mers（100 μM） 0.5 μl 50 pmol
    Gene Specific Primer（2 μM） 0.5 μl 1 pmol

    ＊2 逆転写反応は、必要に応じてスケールアップすることも可能です。10 μlの反応液で逆転写できるのは、およそ500 ngまでのtotal RNAです。


  2. 逆転写反応を行う。
    37℃、15分＊3 （逆転写反応）
    85℃、5秒 （逆転写酵素を熱失活させる）
    4℃

    ＊3 Gene Specific Primerを用いる場合：逆転写反応を42℃、15分で行ってください。
    PCRで非特異的な増幅が生じた場合には、逆転写温度を50℃に変更すると改善される場合があります。


    注： 2.で得た逆転写反応液をリアルタイムPCRの系に持ち込む場合には、PCR反応液容量の10％までとしてください。

※ 増幅領域にexon-junction（イントロン）を含む場合、イントロンサイズが比較的長ければ、調製したRNAサンプルにゲノムDNAが混入していたとしてもゲノムDNA由来の増幅は起こらないか、融解曲線分析によりcDNA由来の増幅産物と区別できる可能性が高くなります。
しかし、イントロンを含まない場合やイントロンサイズが300 bp以下の場合は、鋳型となるtotal RNAの抽出後、DNaseI処理により混入ゲノムDNAを除去することを推奨します。 ゲノムDNA除去反応をプラスしたRT-qPCR専用の逆転写キットPrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)（製品コード RR047A/B）のご利用が便利です。
マニュアルでのゲノムDNA除去操作については、PrimeScript RT reagent Kit説明書をご確認ください。




リアルタイムPCR

Probe qPCR Mix （製品コード RR391S/A/B）と Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズを用いる場合を例として示す。

  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    鋳型以外のコンポーネントを必要本数＋α調製し、リアルタイムPCR専用プレートやチューブに分注後、鋳型を添加する。

    　＜1反応あたり＞ 横にスクロールできます
    試薬 使用量 最終濃度
    （または添加量）
    Probe qPCR Mix（2×） 12.5 μl 1×
    PCR Forward Primer (10 μM) 0.5 μl 0.2 μM
    PCR Reverse Primer (10 μM) 0.5 μl 0.2 μM
    プローブ 1.0 μl
    template 2.0 μl ＊
    滅菌精製水 8.5 μl  
    Total 25 μl  

    ＊ template 溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT 反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。


  2. 反応を開始する。
    PCR反応条件　【シャトルPCR標準プロトコール】
    （初期変性）
    　　95℃、30秒
    （PCR反応：40サイクル）
    　　95℃、5秒
    　　60℃、30秒
    （融解曲線分析）



条件の詳細および他のリアルタイムPCR装置を用いる場合の条件についてはProbe qPCR Mixをご参照ください。