一般的な遺伝子発現解析には、Random 6 mersを使用してください。Random 6 mersを使用すると、PCR用プライマー位置によらず効率の良い逆転写反応を行うことができます。
Oligo dT PrimerpolyAからの逆転写を行いたい場合には、Oligo dT Primerを使用します。 その際、PCR用プライマー位置がpolyAから離れすぎていると、効率よく逆転写反応をすることができません。Oligo dT Primerを単独で使用する場合は、できるだけpolyAから1.5 kb以内に設計されたPCR用プライマーと組み合わせて使用してください。
遺伝子特異的プライマー特定の遺伝子のみを検出する場合には、遺伝子特異的プライマーを逆転写反応に使用できます。この場合、PCR用のReverse Primerを逆転写用プライマーとして使用します。
※ pri-miRNAの様な短鎖RNAの場合には、NucleoSpin miRNA(製品コード 740971.10/50/250)などのsmall RNA精製用試薬 またはRNAiso Plus(製品コード 9108)などのAGPC試薬によりRNA精製を行い、逆転写反応にはRandom 6 mersをお使いください。 total RNAやpolyA+ RNA精製用のスピンカラムタイプのRNA精製試薬はsmall RNA画分がフロースルーに排出されてしまうため、miRNA精製に使用できません。
※ lincRNAの逆転写反応にはOligo dT Primerが使用できます。 その他polyAを持たないnon-coding RNAの逆転写反応にはRandom 6 mersをご使用ください。
試薬 | 使用量 | 最終濃度 (または添加量) |
---|---|---|
5×PrimeScript Buffer (for Real Time) | 2 μl | 1× |
PrimeScript RT Enzyme Mix I | 0.5 μl | |
Oligo dT Primer (50 μM) *1 | 0.5 μl | 25 pmol |
Random 6 mers (100 μM) *1 | 0.5 μl | 50 pmol |
total RNA | ||
RNase Free dH2O | ||
Total | 10 μl*2 |
*1 Oligo dT PrimerとRandom 6 mersの両方を用いるとmRNA全長にわたり効率よくcDNAが合成されます。
なお、各プライマーを単独で用いる場合およびGene Specific Primerの場合の使用量は以下の通りです。
プライマー | 使用量 | 添加量 |
---|---|---|
Oligo dT Primer(50 μM) | 0.5 μl | 25 pmol |
Random 6 mers(100 μM) | 0.5 μl | 50 pmol |
Gene Specific Primer(2 μM) | 0.5 μl | 1 pmol |
*3 Gene Specific Primerを用いる場合:逆転写反応を42℃、15分で行ってください。
PCRで非特異的な増幅が生じた場合には、逆転写温度を50℃に変更すると改善される場合があります。
※ 増幅領域にexon-junction(イントロン)を含む場合、イントロンサイズが比較的長ければ、調製したRNAサンプルにゲノムDNAが混入していたとしてもゲノムDNA由来の増幅は起こらないか、融解曲線分析によりcDNA由来の増幅産物と区別できる可能性が高くなります。
しかし、イントロンを含まない場合やイントロンサイズが300 bp以下の場合は、鋳型となるtotal RNAの抽出後、DNaseI処理により混入ゲノムDNAを除去することを推奨します。
ゲノムDNA除去反応をプラスしたRT-qPCR専用の逆転写キットPrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(製品コード RR047A/B)のご利用が便利です。
マニュアルでのゲノムDNA除去操作については、PrimeScript RT reagent Kit説明書をご確認ください。
Probe qPCR Mix (製品コード RR391S/A/B)と Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズを用いる場合を例として示す。
試薬 | 使用量 | 最終濃度 (または添加量) |
---|---|---|
Probe qPCR Mix(2×) | 12.5 μl | 1× |
PCR Forward Primer (10 μM) | 0.5 μl | 0.2 μM |
PCR Reverse Primer (10 μM) | 0.5 μl | 0.2 μM |
プローブ | 1.0 μl | |
template | 2.0 μl | * |
滅菌精製水 | 8.5 μl | |
Total | 25 μl |