幹細胞・再生医療研究ガイド

iPS細胞のゲノム編集

  • ◆ GMPグレードの組換え型Cas9タンパク質
    Recombinant Cas9 Protein GMP grade(製品コード T230)
    • 現在最も広くゲノム編集に用いられている化膿性レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)由来のCas9タンパク質より開発された組換えタンパク質
    • 哺乳動物細胞への導入時に生じる細胞へのダメージを低減するように溶液組成を最適化
    • 本Cas9タンパク質とガイドRNAを細胞内に導入することで、高効率なゲノム編集が可能
    • 医薬品の製造・品質管理基準であるGMPに準拠しており、高い品質を担保
    【お客様のご評価結果例 ~他社Cas9タンパク質製品との性能比較~】
    (下記のデータは、京都大学 iPS細胞研究所(CiRA)臨床応用研究部門 主任研究員/特定拠点講師 堀田秋津先生、および堀田研究室 博士研究員 徐淮耕 先生よりご提供いただきました。)
    他社Cas9タンパク質製品との性能比較
    各5 μgのA社Cas9、A社Cas9変異体、B社Cas9、およびRecombinant Cas9 Protein GMP grade と sgRNA(0.625 μg ×2種類)をエレクトロポレーション法によりヒトiPS細胞へ導入することで、2種類の細胞表面タンパク質A(Gene A)、B(Gene B)をそれぞれ別々に、あるいは同時にノックアウトした。その結果得られた細胞の表面タンパク質A、Bの発現をフローサイトメーターで測定し、タンパク質レベルでのノックアウト効率(%)をプロットした(左グラフ)。

    実験は3回実施し、エラーバーはS.D.(標準偏差)を表す。

    結論
    弊社のGMPグレードCas9タンパク質は、高いノックアウト効率を安定して示しました!

  • ◆ iPS細胞へのCRISPR/Cas9ゲノム編集システム
    ★ ゲノム編集のためのガイドRNAとCas9などを細胞へ導入する3つの方法をご紹介致します。
    エキソソーム様小胞(Gesicle)を用いた導入方法
    • エキソソーム様小胞(Gesicle)を利用してCas9タンパク質/sgRNAを直接細胞に導入
    • トランスフェクション効率が低い哺乳類細胞(分裂細胞、非分裂細胞、iPS細胞)でも効率よくゲノム編集が可能
    • Cas9タンパク質/sgRNA複合体が迅速に細胞内から除かれるため、オフターゲットを軽減
    プラスミドベクターを用いた導入方法
    Guide-it CRISPR/Cas9 System (Green) / (Red)(製品コード 632601 / 632602)
    • Cas9 とsgRNAを同時に発現できる便利なワンベクタータイプ
    • sgRNA発現用オリゴDNAを準備するだけですぐに使える簡便で迅速なシステム
    • マーカーとして蛍光タンパク質(ZsGreen1またはtdTomato)を搭載
    アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを用いた導入方法
    • アデノ随伴ウイルス(AAVベクターを用いてCas9、sgRNAを導入
    • AAV CRISPR/Cas9の生成に必要な全てのコンポーネントを含んだAll-in-oneシステム
    • Cas9のゲノムへの組み込みによる持続的なCas9の発現を排除し、細胞毒性やオフターゲットの影響を軽減
    【ヒトiPS細胞におけるCD81のノックアウト】

    iPS細胞のノックアウト効率ならびに未分化維持を、CD81を認識するFITC標識抗体、SSEA4を認識するPE標識抗体をそれぞれ用い、フローサイトメトリーにより解析した。Cas9/sgRNA Gesicleでの処理により、未分化を維持したまま(パネルD)、約10%のCD81ノックアウトが確認できた。
    * SSEA4:iPS細胞の未分化マーカー

    ゲノム編集製品の詳細はこちら
    <導入システム編>
    <サポートツール編>
    【ゲノム編集ノックインの実施例 ~iPS細胞を用いた鎌形赤血球原因遺伝子のゲノム編集~】
    横にスクロールできます
    DNA塩基配列がA/TからT/Aに突然変異を起こすと、その結果mRNAが変化し、蛋白質のアミノ酸が1つ変化する。左図の例はヘモグロビンβ鎖蛋白質の6番目のグルタミン酸(Glu)が(Val)に変異して鎌状赤血球貧血症を引き起こす場合を示している。
    sgRNAおよびCas9-EF1α発現プラスミドDNAとssODNをヒト iPS細胞 253G1に導入し、各クローンについて、ゲノムターゲット領域のシーケンスを実施した。101クローンの内、1つノックインされたクローンを獲得できた。
  • ◆ iPS細胞のシングルセルクローニング
    Cellartis® DEF-CS™ 500 Culture System (製品コード Y30010)
    • 高効率なシングルセルクローニングに最適
    • フィーダーフリー条件下でシングルセルに分散した状態で継代が可能
    • 培地と培地添加剤、プレートコーティング剤を含むオールインワンの培養システム
    【シングルセルクローニングの効率】

    DEF-CSシステムは、3種のiPS細胞株において、他社培地と比較して最も高いシングルセルクローニング効率を示した。  (弊社比較データ)
    【TRA1-60、SSEA4未分化マーカーの発現確認】

    各培地を用いたシングルセルクローニングにて取得したiPS細胞クローン各5個ずつを選択し(クローニング細胞が5個未満の場合は全クローンを選択)、拡大培養後、TRA-1-60とSSEA4の未分化マーカー発現をフローサイトメトリーで解析した。DEF-CSで取得したクローンは、未分化マーカーの高い陽性率と発現強度を示した。一方、他社培地で得られたクローンは、未分化マーカーの発現が一部またはほとんど消失していた。  (弊社比較データ)

    結論

    Cellartis DEF-CS Culture Systemを用いたヒトiPS細胞のシングルセルクローニングを検討した結果、他社製品と比較して、高効率にiPS細胞のシングルセルクローニングが可能であり、iPS細胞をより安定して増殖させることができた。
    さらに、クローニング後のiPS細胞の未分化状態は、Cellartis DEF-CS Culture Systemで高く維持できたが、他社製品では未分化マーカー発現が一部またはほとんど消失していた。
  • ◆ ゲノム編集による目的クローンのスクリーニング
    Guide-it™ Genotype Confirmation Kit(製品コード 632611)
    • ゲノム編集後のクローンのジェノタイピングにより、遺伝子型を同定
    • 高品質Cas9ヌクレアーゼとsgRNAを用いたin vitro DNA切断反応による簡単ジェノタイピング
    • タイピング用DNA断片は細胞の抽出液から直接PCRにより調製
    【Cas9/sgRNAのin vitro DNA切断反応による遺伝子型同定の原理】
    横にスクロールできます
    遺伝子型クローン化細胞からの増幅配列Cas9/sgRNAによるDNA切断反応電気泳動パターン
    野生型
    片アレル型
    両アレル型
    は、Cas9/sgRNAにより認識され、DNA切断反応により完全に切断される。
    は、ゲノム編集による改変が入っているため、Cas9/sgRNAにより認識できず切断されない。
    【実験例:クローン化したゲノム編集細胞(HEK293)のジェノタイピング結果】

    1、4、10、12 のクローンは変異が入っていない野生型(WT)。2のクローンは片アレル変異体(M)、3、5~9、11、13~15 のクローンは両アレル変異体(B)であることが確認できました。

    ゲノム編集製品の詳細はこちら
    <導入システム編>
    <サポートツール編>