実験方法について

CycleavePCR Starter Kit(製品コード CY505S)またはCycleavePCR Reaction Mix(製品コード CY505A/B)と組み合わせて使用し、説明書に従って反応を行ってください。設計されたプライマー・プローブセットは、反応条件の至適化は不要です。

■SNP解析における特異性確認

あらかじめ、タイピングが明確な精製DNAサンプル(Allele 1 homo、Allele 2 homo)を用い、対応するプローブのみで検出できるか確認することをお勧めします。陽性コントロールには、各タイプの増幅領域配列を有した人工合成遺伝子を用いることが可能です。

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■使用方法

(1)用意するもの(主なもの)

CycleavePCR Starter Kitは、CycleavePCR Reaction Mixに加え、試薬の反応性を確認するためのPositive Controlを含んでおり、反応系を構築する際に便利です。反応系構築後は、コストパフォーマンスの高いCycleavePCR Reaction Mixがお勧めです。


(2)プロトコール
<2波長(FAM/ROX)同時検出系の調製例:Thermal Cycler Dice Real Time System IIIの場合>
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    ROX Reference Dyeは不要
    反応液組成
    <1反応あたり>
    横にスクロールできます
    試薬使用量最終濃度
    CycleavePCR Reaction Mix(2×)12.5 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM
    FAM標識サイクリングプローブ(5 μM)1 μl0.2 μM
    ROX標識サイクリングプローブ(5 μM)1 μl0.2 μM
    template(約1~100 ng/μl)1 μl 
    滅菌精製水9.5μl 
    total26μl 

  2. 以下のPCR条件で反応を開始する。
     反応条件
    (初期変性)
     95℃ 10秒
    (PCR反応:45サイクル)
     95℃ 5秒
     55℃ 10秒
     72℃ 20秒(蛍光検出)

    条件の詳細および他のリアルタイムPCR装置を用いる場合のPCR条件等については、CycleavePCR Starter KitまたはCycleavePCR Reaction Mixの取扱説明書をご参照ください。