実験方法について

CycleavePCR Starter Kit(製品コード CY505S)またはCycleavePCR Reaction Mix(製品コード CY505A/B)と組み合わせて使用し、説明書に従って反応を行ってください。設計されたプライマー・プローブセットは、反応条件の至適化は不要です。

■SNP解析における特異性確認

あらかじめ、タイピングが明確な精製DNAサンプル(Allele 1 homo、Allele 2 homo)を用い、対応するプローブのみで検出できるか確認することをお勧めします。

■使用方法

(1)用意するもの(主なもの)

CycleavePCR Starter Kitは、CycleavePCR Reaction Mixに加え、試薬の反応性を確認するためのPositive Controlを含んでおり、反応系を構築する際に便利です。反応系構築後は、コストパフォーマンスの高いCycleavePCR Reaction Mixがお勧めです。


(2)プロトコール
<2波長(FAM/ROX)同時検出系の調製例:Thermal Cycler Dice Real Time System IIIの場合>
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    ROX Reference Dyeは不要
    反応液組成
    <1反応あたり>
    横にスクロールできます
    試薬使用量最終濃度
    CycleavePCR Reaction Mix(2×)12.5 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM
    FAM標識サイクリングプローブ(5 μM)1 μl0.2 μM
    ROX標識サイクリングプローブ(5 μM)1 μl0.2 μM
    template(約1~100 ng/μl)1 μl 
    滅菌精製水9.5μl 
    total26μl 

  2. 以下のPCR条件で反応を開始する。
     反応条件
    (初期変性)
     95℃ 10秒
    (PCR反応:45サイクル)
     95℃ 5秒
     55℃ 10秒
     72℃ 20秒(蛍光検出)

    条件の詳細および他のリアルタイムPCR装置を用いる場合のPCR条件等については、CycleavePCR Starter KitまたはCycleavePCR Reaction Mixの取扱説明書をご参照ください。