幹細胞研究ガイド


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◆ ヒトES/iPS細胞培養システム
◆ Xeno FreeのヒトiPS細胞用培地
◆ マウス・ラットES細胞用培地
◆ ヒト・マウス神経幹細胞用培地
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  • ◆ ヒトES/iPS細胞培養システム
    【シングルセルにしたiPS細胞が単層状に増殖していく様子】

    ヒトiPS細胞株(253G1)を本製品のプロトコールに従いシングルセルにまで分散し、トリパンブルーで染色した。ほとんどの細胞が生細胞であることを確認後、本培地にて細胞を播種し培養を行った。
    Cellartis DEF-CS 500 Culture Systemを用いた培養では、単一細胞に分散した状態で継代可能であった。
    ▶▶ 培養実験動画はこちら
    【未分化マーカーの発現を比較】

    上記の培養条件① 〜 ④でヒトiPS細胞株(253G1)を5週間培養後、細胞を回収して未分化マーカーTRA1-60の発現をフローサイトメトリーにて解析した。
    Cellartis DEF-CS 500 Culture Systemで培養した細胞は高い陽性率と発現強度を示した。
    (弊社比較データ)
  • ◆ Xeno FreeのヒトiPS細胞用培地
    • 動物・ヒト由来成分不含(Xeno-Free)
    • シングルセルでの継代が可能
    • 未分化状態での長期間の継代が可能(多機能性、自己再生、分化能のポテンシャルを長期間維持)
    • 前臨床での使用に最適
    • ロット間差が少なく安定したiPS細胞培養が可能

    未分化状態での長期間の培養が可能
    本製品を用いてヒトiPS細胞の継代を10回行った後、未分化能の状態が維持されていることを未分化マーカーOct-4とSSEA4に対する免疫染色で確認した。プレートコーティング剤はCorning Synthemax II-SC Substrate(Corning社, Cat. No. 3535)を使用


    長期間継代後も多分化能を維持
    本製品を用いてヒトiPS細胞の継代を10回行った後、三胚葉への分化能が維持されていることを各胚葉特異的抗体での免疫染色(中胚葉ではASMA、外胚葉ではβIII-tubulin、内胚葉ではSOX17、HNF4aを検出)で確認した。下図の核染色はDAPIを使用。培養時のプレートコーティング剤はCorning Synthemax II-SC Substrate(Corning社, Cat. No. 3535)を使用

    推奨のプレートコーティング剤:iMatrix-511(製品コード 892011)
    • 多能性幹細胞を未分化状態で培養可能な研究用培地
    • 簡便、安定に細胞増殖が可能
    • 動物由来成分不含(ヒト由来成分は含有)
    • フィーダーフリー条件下で培養が可能
    • iPS細胞のクローニングが可能
    • 外胚葉、中胚葉、内胚葉への分化が可能
    • 多様な足場材での培養が可能
    ヒトiPS細胞の未分化マーカーの発現
    ヒトiPS細胞株(201B7)を本製品で、3継代の培養を行った後(28日目)、未分化マーカーOct3/4の発現を免疫染色で解析した。プレートコーティング剤はiMatrix-511(製品コード 892011)を使用。
  • ◆ マウス・ラットES細胞用培地
    3種類の低分子阻害剤(3i)による分化誘導シグナル抑制
    マウスES細胞用 iSTEM(製品コード Y40010)
    • 無血清、フィーダーフリー、サイトカイン無添加の条件下で“Ground State”を維持したままマウスES細胞の培養が可能な完全合成培地
    • 難誘導マウス種からのES細胞株の誘導時にも使用可能
    • C57BL/6NマウスでのGerm-line transmission効率が良好
    • iSTEM培地で培養したマウスES細胞は、LIF、BMPの存在下での培養と同程度の倍加時間で増殖を続け、さらに、より高い多能性クローン形成能を示す

    【未分化状態の維持】
    iSTEM培地、またはD社培地で培養したマウスES細胞E14Tg2A株(左)とアルカリフォスファターゼ染色画像(右)
    iSTEM培地で培養した細胞は、ムラのない染色像から均一な未分化細胞であることが分かる。     (弊社比較データ)

    C57BL/6Nマウスでのキメラ率の比較実験
    ジーンターゲティングを目的として、iSTEM培地およびA社培地で10継代培養したマウスES細胞(C57BL/6Nマウス由来)を8細胞期胚(CD1(ICR))にインジェクションし、翌日移植して生まれてくるマウス個体の毛色にてキメラ率を検証した。
    その結果、iSTEM培地を使用した場合、マウスは全てC57BL/6N由来の黒い毛色であり、キメラ率が良好であることが確認できた。

    独立行政法人 理化学研究所 生命システム研究センター
    細胞デザインコア合成生物学研究グループ
    鵜飼 英樹先生よりデータをご提供いただきました。
    2種類の低分子阻害剤(2i)による分化誘導シグナル抑制
    マウス・ヒトES/iPS細胞用 GS2-M(製品コード Y40030) ★お求めやすい価格となりました★
    • LIFの添加培養により、マウスのpartial iPS細胞やpre-iPS細胞を完全な多能性iPS細胞に変換可能
    • nativeなground stateマウス多能性幹細胞の長期間の維持は、GS2-M培地だけで可能
    • 2i 阻害剤は、生殖系列に分化可能なES細胞を得ることが困難であったマウスの種からの誘導や、ヒトおよび家畜iPS細胞を作製する目的にも使用されている。
    ラットES/EG細胞用 GS1-R(製品コード Y40020) ★お求めやすい価格となりました★
    • GS1-R培地により維持されたラットES細胞は生殖系列への分化が可能であり、相同組換えやゲノム編集技術を用いることによりトランスジェニックラットやノックアウトラットを作製することができる。
  • ◆ ヒト・マウス神経幹細胞用培地
    • NDiff 227培地のみでマウスES細胞を神経細胞へ分化させることが可能
    • 添加因子を加えることにより、マウスES細胞の無血清、フィーダー細胞非存在下での培養にも使用可能
    • 増殖因子を添加することにより、ヒトES細胞の培養や、ground state でのヒトiPS細胞培養にも利用可能
    • FGFを添加することにより、 NDiff 227培地はマウスES細胞から、肝臓や膵臓へ分化できるADE(Anterior Definitive Endoderm)前駆体を生じることも可能
    • NANOGおよびKLF2をヒトの多能性幹細胞に過剰に発現させ、 NDiff 227培地を利用して培養すると、 約10〜14日で平坦な形状をとるプライム型の多能性幹細胞からナイーブ型のドーム状のコロニーへと 変化する報告もある。
    【マウスES細胞の神経分化(Ndiff 227使用)】
    • EGFやFGF-2を添加して使用することで、無血清で接着培養状態の神経幹細胞の維持や拡大培養に使用可能
    • 増殖因子を加えずに本培地で神経幹細胞を接着培養すると、神経細胞に機能的に分化することが可能
    • in vitroでのヒト脳の器官初代培養において、放射状グリア由来の神経幹細胞の拡大培養や分化にも使用可能
    【マウスES細胞の神経前駆細胞への分化(RHB-A使用)】
    1. フィーダーフリーの継代数の低いES細胞を0.5〜2×104 cells/cm2の密度でゼラチンコートのプレートにRHB-A培地を用いて播種する。
    2. 1〜2日ごとに培地を交換する。神経細胞への分化の初期段階でかなりの数の死細胞が観察される。
    3. 神経細胞への分化を形態観察、またマーカーの発現などで観察する神経細胞への分化は、4〜6日目から観察され、7〜9日目にニューロン成熟が見られる。
    • 増殖因子や神経細胞用の添加因子を含まない無血清の基本培地。細胞の種類にあわせて必要な添加因子を加えて使用することが可能

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