幹細胞研究ガイド

遺伝子改変T細胞の作製・培養

がんを標的とする遺伝子改変T細胞(Tリンパ球)を用いたがん治療法は、従来法では治療が困難ながんにも有望なアプローチとして近年注目されています。本治療法では、がん患者からT細胞を分離し、遺伝子操作によって標的能をもつTCR(T細胞受容体)またはCAR(キメラ抗原受容体)を導入した遺伝子改変T細胞をin vitroで増殖させた後、患者に投与されます。また、これまでに行われた遺伝子改変T細胞を用いた多くの臨床試験において、タカラバイオのRetroNectinが使用されています(参考文献はこちら)。
ここでは、遺伝子改変T細胞の作製・培養のワークフローにおいて、使用実績のある製品をご紹介します。

TCR/CARの遺伝子導入
ウイルスベクター
遺伝子導入の促進
RetroNectin
Tリンパ球の刺激
RetroNectin

抗CD3抗体
遺伝子改変Tリンパ球の拡大培養
リンパ球培養用培地

ガス透過性細胞用バック
Tリンパ球の分離
分離・洗浄液
分離・洗浄液
CELLOTION
  • ケミカリーディファインドな細胞洗浄・回収液
  • 遠心・洗浄時の細胞の損失を防止
  • 糖類、タンパク質および血清成分不含

PBSやRPMIなど細胞洗浄液の代用としてご使用ください

全血からの末梢血単核球(PBMC)分離例

血液からリンパ球や単球を分離採取する試薬とCELLOTIONを併用して、血液からの末梢血単核球分離操作を行った結果、PBS使用時の1.3倍の細胞が回収でき(パネルA)、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19抗原陽性細胞の回収率も増加した(パネルB)。
特にCD14陽性細胞(単球)で高い回収率の向上()が認められた。単球は白血球の中でも接着性の高い細胞であることから、通常の回収方法では回収ロスが多く、CELLOTIONを使用することで顕著に回収率が向上したと考えられる。
【A】 血液3 mlからの回収細胞数
【B】 血液3 mlからの免疫表現型の回収細胞数
TCRレパトア解析用キット
SMARTer® Human scTCR a/b Profiling Kit
  • イルミナ社次世代シーケンサー(NGS、MiSeq推奨)用ライブラリー調製キット
  • マルチプレックスPCRに依らず、ヒトTCRmRNAの完全長V(D)Jのシーケンスが可能
  • シングルセル解析のため、TCRα鎖、β鎖のペアリング情報を取得可能
  • 96個のシングルセルに8種類のインデックスを付加後プール。8個のシングルセルをまとめて
    ライブラリー調製できるため、ハイスループットな作業が可能

SMARTer® Human TCR a/b Profiling Kit
  • イルミナ社NGS(MiSeq推奨)用ライブラリー作製キット
  • TCR mRNAの完全長V(D)J可変領域のシーケンスが可能
  • TCRα鎖、TCRβ鎖を同時または個別にライブラリー作製可能
  • 末梢血由来total RNA 10 ng〜3 μgまたはT細胞 50〜10,000個からライブラリー作製が可能

SMARTer® RACE 5'/3' Kit
  • SMARTer技術を利用して、微量RNAからでも完全な5'末端あるいは3'末端cDNAを取得
  • わずか10 ngのtotal RNAからスタート可能
  • キメラ抗原受容体発現T細胞(CAR-T細胞)の抗体可変領域のクローニング実績あり
ウイルスベクター
レンチウイルスベクター
  • ほぼ全ての哺乳動物細胞へ目的遺伝子の導入と発現が可能
  • 長期にわたる遺伝子発現が可能

  • ウイルスベクター選択ガイド(レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス)についてはこちら
RetroNectin
RetroNectin® GMP grade
  • RetroNectinを用いた培養によりT細胞の培養効率が増大し、得られるT細胞集団中にナイーブT細胞()が多く含まれる
    ナイーブT細胞は未分化な細胞で、抗原提示を受けて細胞傷害性T細胞に分化する能力を持つ
  • レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターによる哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を向上
  • GMPに準拠した製造・品質管理
  • 動物由来成分不含
RetroNectin GMP gradeは、CH-296 with Carbonateとして米国FDAのドラッグマスターファイルに登録準備中です。
RetroNectinを用いたリンパ球拡大培養を研究目的以外で実施する場合には、個別に弊社とのライセンス契約の締結が必要です。
末梢血単核球への遺伝子導入
ヒト末梢血単核球(PBMC)にZsGreen1を発現するレンチウイルスベクターをポリブレン法とReroNectin法で導入した。

その結果、ポリブレン法では10倍希釈したレンチウイルスで32.5%の陽性率を示したが、RetroNectinを用いたRBV-Spin法では10倍希釈したウイルスを使用した場合で63.2%もの高い陽性率を示し、また90倍希釈したウイルスを用いても42.7%の高い陽性率が得られた。

RBV-Spin法、ポリブレン法の詳細はこちら
抗CD3抗体
Anti-CD3 mAb GMP grade
  • T細胞刺激用抗体OKT3クローン(Isotype: mouse IgG2a)抗体
  • GMPに準拠した製造・品質管理
  • 動物由来成分不含
  • RetroNectinと共刺激することによりTリンパ球(T細胞)を効率よく拡大培養することが可能
RetroNectin共刺激によるTリンパ球拡大培養
ヒト末梢血単核球(PBMC)を固定化Anti-CD3 mAbとRetroNectin(RN)の共刺激下で4日間培養後、リンパ球培養用培地で適宜希釈しながら、さらに10日間培養を行った。
RetroNectinの使用により、細胞増殖率の向上およびナイーブT細胞比率(CD45RA CCR7陽性細胞比率)の上昇がみられた。

donor A    donor B
リンパ球培養用培地
LymphoONE™ T-Cell Expansion Xeno-Free Medium
  • 動物由来成分を含まないXeno-Free培地
  • 無血清培養でもヒトTリンパ球の増殖性を維持し、拡大培養に最適
  • 抗CD3抗体とレトロネクチンの共刺激による培養により、抗腫瘍活性を発揮するナイーブTリンパ球を多く含む
RetroNectin共刺激によるTリンパ球拡大培養(他社培地との比較)
ヒト末梢血単核球(PBMC)をCultiLife 215 Culture bag固定化Anti-CD3 mAbとRetroNectin(RN)の共刺激下で4日間培養後、IL-2を含むリンパ球培養用培地を用い、血清(human AB serum)無添加の条件で10日間培養を行った。

その結果、LymphoONE T-Cell Expansion Xeno-Free Mediumは血清無添加でも安定した細胞増殖性を示し、ナイーブT細胞比率(CCR7 CD45RA)が高いことが確認できた。
(弊社取得データ)
ガス透過性細胞用バッグ
 
GT-T610 (CultiLife Eva) Culture bag
CultiLife 215 Culture bag
Partition Clip for CultiLife 215
  • フラスコよりも高い細胞増殖率を実現
  • 閉鎖系培養を可能にし、コンタミネーションおよび培養作業者の感染リスクを低減
  • 各種連結ポートにより、容易に液輸送が可能
  • 透明性に優れた素材で、容易に顕微鏡観察が可能
細胞凍結保存剤
STEM-CELLBANKER GMP grade
  • GMPに準拠した製造管理および品質管理を実施
  • 幹細胞・iPS細胞用細胞保存液
  • 既知成分により合成された無血清タイプ
  • 動物由来の成分を含まない
  • DNA、RNAを損傷せず、組織の凍結保存が可能
STEM-CELLBANKER GMP gradeは、STEM-CELLBANKERとして原薬等登録原簿(マスターファイル)に登録されています。


マイコプラズマ
ウイルステスト
TaKaRa Mycoplasma qPCR Detection Kit
  • 第十七改正日本薬局方のマイコプラズマ否定試験に従い検出感度・特異性・頑健性について確認済み
  • リアルタイムPCR法により1日で結果判定が完了

Virus Test Kit
  • 厚生労働省の指針収載の9種類のウイルスを検出
  • B型肝炎(HBV)、C型肝炎(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症、成人T細胞白血病(HTLV)、パルボウイルスB19感染症
  • サイトメガロウイルス感染、EBウイルス感染及びウエストナイルウイルス感染


■CAR-T/TCR遺伝子治療臨床試験におけるRetroNectin GMP gradeの使用例
  • T cells expressing an Anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of multiple myeloma.
    Ali, S. A. et al., Blood (2016) 128: 1688-1700.
  • CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.
    Brentjens, R. et al., Science Translational Medicine (2013) ; 5: 177ra38.
  • Adoptive cell therapy: honing that killer instinct.
    Humphries, C. Nature (2013) 504: S13-S15.
  • B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells.
    Kochenderfer, J. N. et al., Blood (2012) 119: 2709-2720.
  • Immunotherapies: exploiting the immune system for cancer treatment.
    Koury, J. et al., J. Immuno. Res. (2018) 585614.
  • Clinical and immunological responses after CD30-specific chimeric antigen receptor-redirected lymphocytes.
    Ramos, C. A. et al., J. Clin. Invest. (2017) 127: 3462-3471.
  • Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1.
    Robbins, P. F. et al., J. Clin. Oncol. (2011) 29: 917-924.
  • Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells.
    Stroncek, D. F. et al., Cytotherapy (2016) 18: 893-901.
  • Third-generation CD28/4-1BB chimeric antigen receptor T cells for chemotherapy relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia: A non-randomised, open-label phase I trial protocol.
    Tang, X. Y. et al.,BMJ Open. (2016) 6: e013904.
  • Chimeric antigen receptor T-cells for the treatment of B-cell acute lymphoblastic leukemia.
    Tomuleasa, C. et al., Front. Immunol. (2018) 19: 239.
  • Evaluation of γ-retroviral vectors that mediate the inducible expression of IL-12 for clinical application.
    Zhang, L. et al., J. Immunother. (2013) 35: 430-439.

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